1、實驗準(zhǔn)備與環(huán)境檢查

 

　　在超凈臺或?qū)Ｓ肞CR準(zhǔn)備區(qū)進行試劑配制，避免外源DNA污染。穿戴手套、口罩和實驗服，使用無DNA酶的耗材（如PCR管、槍頭）。檢查擴增儀電源連接是否正常，確認(rèn)熱蓋（HeatedLid）硅墊清潔無破損，加熱塊適配所用PCR管或板型（0.2mL單管、8聯(lián)管或96孔板）。

 

　　2、配制PCR反應(yīng)體系

 

　　根據(jù)實驗需求，精確配制反應(yīng)混合液（MasterMix），包括模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶、緩沖液等。建議在冰上操作，防止酶提前激活。將混合液分裝至PCR管或板中，蓋緊管蓋，避免氣泡產(chǎn)生。

 

　　3、裝載樣品并關(guān)閉熱蓋

 

　　將PCR管或板整齊放入儀器加熱塊中，確保每個樣品與模塊充分接觸。輕柔關(guān)閉熱蓋，使其壓緊PCR管蓋，防止高溫循環(huán)中管蓋爆開或液體蒸發(fā)。若使用無熱蓋機型，需在每管中加入礦物油覆蓋。

 

　　4、程序設(shè)置與啟動

 

　　打開控制面板或連接軟件，新建或調(diào)用預(yù)設(shè)程序。準(zhǔn)確設(shè)置三步循環(huán)參數(shù)：

 

　　變性：通常94–98°C，20–30秒

 

　　退火：根據(jù)引物Tm值設(shè)定，50–65°C，20–30秒

 

　　延伸：72°C，按1kb/min計算時間

 

　　設(shè)置循環(huán)數(shù)（通常30–40次），以及初始變性和最終延伸步驟。確認(rèn)無誤后啟動程序，儀器將自動開始溫控循環(huán)。

 

　　5、運行監(jiān)控與結(jié)束操作

 

　　運行期間可通過屏幕觀察實時溫度曲線，確保各階段溫度準(zhǔn)確。程序結(jié)束后，儀器通常會自動降溫至4–10°C保存樣品。此時方可打開熱蓋，取出PCR產(chǎn)物，立即進行后續(xù)分析（如電泳、測序）或–20°C保存。